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翻译后修饰蛋白质组学研究的新技术策略

日期:2014年09月24日
 

李振亚1*,顾宏博2
(1Cell signaling Technology中国公司,上海 200120;
2PTMScan Group, Cell signaling Technology, Danvers, MA, 01923, United States)

摘要:利用Cell Signaling Technology (CST)公司开发的针对蛋白质翻译后修饰(PTM)基序(motif)抗体,在肽段水平上免疫亲和富集带有不同PTM的肽段,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行定量分析,能够快速、准确、高通量地分析多种疾病相关信号通路关键节点蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化修饰的变化,满足创新性研究、生物标志物鉴定、药物靶点筛选和评价的需求。
关键词:翻译后修饰;蛋白质组学;基序抗体;免疫亲和富集;质谱

    翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程。它通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团,可以改变蛋白质的物理、化学性质,进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用[1]。根据蛋白质翻译后修饰的专业数据库PhosphoSitePlus®(http://www.phosphosite.org)统计结果显示,目前研究较多的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化四类修饰[2]。
    由于蛋白翻译后修饰位点数量众多,需要高通量的分析方法进行规模化解读。而生物质谱(主要利用ESI-LC-MS/MS)可以对蛋白质酶解肽段样品的分子量、丰度、氨基酸序列、修饰位点等信息进行高通量分析,并结合生物信息学分析(如SEQUEST匹配分析)可以鉴定肽段来源的蛋白质名称[3]。
    尽管质谱仪器的分析能力近年来有了长足的发展,但是由于蛋白翻译后修饰化学计量值低、复杂性大,直接将蛋白组(如全细胞裂解产物,组织匀浆产物或全血清蛋白)的酶解肽段送入质谱鉴定和定量PTM是非常困难的。因此,很多翻译后修饰的富集方法会被采用,来提高样品中PTM肽段的丰度和相对比例,从而提高了质谱对翻译后修饰位点的鉴定效率[4]。
    由于蛋白磷酸化修饰是生物体内最为普遍也是研究最为深入的修饰方式,而其中的酪氨酸磷酸化,特别是酪氨酸激酶受体的磷酸化已经被证明对癌细胞的诱发和生长有关键作用,多种针对不同酪氨酸激酶受体的小分子抑制剂和单克隆抗体也已经被开发成为治疗癌症的一线药物[5]。由于酪氨酸磷酸化的相对丰度极低,只占磷酸组的1%,所以针对酪氨酸磷酸化的抗体一直是分析此种磷酸化的首选方法[6]。Cell Signaling Technology(CST)的科学家于2005年首次发表PTMScan技术实现利用基序抗体(motif antibody)在肽段水平免疫富集酪氨酸磷酸化和下游的定量质谱分析[7]。以此为基础,CST继续开发针对不同PTM的特异性基序抗体,拓展PTMScan技术的应用范围,先后推出PhosphoScan®(激酶底物选择性磷酸化富集)、AcetylScan®(赖氨酸乙酰化)、UbiScan®(赖氨酸泛素化)、MethylScanTM(赖氨酸和精氨酸甲基化)和PTMScan Direct®(信号传导关键点位磷酸化修饰富集)等多种试剂以满足不同的研究需要。
     在本文中,我们将重点论述利用单克隆基序抗体对含有PTM肽段进行免疫亲和富集并联合液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析的PTMScan新技术策略在多种翻译后修饰研究中的应用。

1 PTMScan® 技术基本流程

PTMScan®技术的基本操作方法包括利用9M尿素裂解液,对疾病细胞系或患者组织块(足够提取10 mg蛋白)进行裂解获取蛋白裂解物,经过蛋白内切酶(通常使用胰酶)消化后获得蛋白肽段混合物,利用C18纯化柱对肽段混合物进行纯化,然后利用CST公司独有的蛋白质翻译后修饰motif抗体分别对含有不同蛋白后修饰的肽段进行亲和富集并纯化,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行半定量分析(图1)。

 
2 PTMScan® 技术分类
    根据所使用的抗体是否对肽段序列具有靶向性,PTMScan®技术分为PTMScan® Discovery以及PTMScan® Direct两大类:其中PTMScan® Discovery是在蛋白组整体水平上对带有某一种PTM的肽段进行特异性亲和富集,富集结果与肽段的蛋白来源没有关系,而肽段在样品中的相对丰度越高,越容易被鉴定。这种高通量的蛋白组学的研究方法特别适合分析某一PTM在不同条件下和不同样品中的定量变化。
    而PTMScan® Direct适用于分析某一信号传道通路中的关键节点蛋白的PTM的定量变化。PTMScan® Direct试剂不仅对特定的PTM有亲和力,而且还对PTM旁侧的氨基酸序列同样有亲和力,这样,Direct的结果通常和样品本身关系不大,即只要该位点PTM存在于样品中,该肽段就会被富集、检测和定量。例如:PTMScan® Direct中的Cell Cycle /DNA Damage试剂可以同时对在细胞周期调控和DNA损伤应答通路的多个功能蛋白以及关键点位的修饰进行一次性深入分析,其中参与细胞周期调控蛋白包括DNA扶志蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白依赖激酶和相应周期蛋白;而参与DNA损伤应答通路的蛋白包括各种关卡蛋白(ATM、ATR、Chk1、Chk2和ATRIP)、应激反应激酶(p38、MAPK 和JNK),以及DNA修复重组因子。
 
2.1 PTMScan® Discovery
 
    PTMScan® Discovery包括针对磷酸化、赖氨酸乙酰化、赖氨酸泛素化和赖氨酸、精氨酸甲基化的试剂。其中,由于磷酸化的复杂性,PhosphoScan可根据各种磷酸激酶识别底物的序列特异性提供16种不同的单克隆基序抗体(motif antibody)供选择。例如:蛋白激酶A (PKA)在其底物的(K/R)(K/R)X(S/T)序列进行特异性磷酸化,即在磷酸化位点的-2和-3位须为赖氨酸或者精氨酸。我们设计的PKA底物基序抗体(PKA substrate motif antibody)识别含有(K/R)(K/R)X(pS/T)的肽段,这些肽段有很大可能来自PKA 的底物。相比于TiO2或者IMAC亲和富集磷酸化肽段等方法,使用基序抗体可以快速特异地富集该激酶底物。
    通过大量的实验我们认为:利用识别磷酸化的基序抗体可以更加专一、有的放矢地研究磷酸组的某一个亚群。越来越多的研究者认为,磷酸组的复杂性大大超过了现有仪器设备的分析能力上限,而且没有一种分析方法可以富集到磷酸组的全部位点。通用的IMAC或者TiO2富集磷酸化肽段的方法虽然可以鉴定出客观数量的磷酸化位点,同时却也给后续定性定量分析和手动验证带来了极大的困难。使用磷酸化基序抗体的好处在于,可以在富集前利用这些抗体进行western blot对样品进行检测,这样可以直观地判断出在某种实验条件下,哪些磷酸化基序抗体可以检测出最显著的变化。如图2所示:利用PKA底物基序抗体作为一抗的western blot, 表示两种细胞在不同实验条件下的反馈。我们可以直观地看到:与细胞A的带谱相比,细胞B明显对于实验条件更加敏感(对比
第7和第11号样品的条带变化)。因此我们可以选择使用PKA底物的基序抗体对第7和第11的样品进行免疫亲和富集以及质谱定量分析来确定这种实验条件对哪些蛋白的磷酸化位点造成了影响。另外,我们发现利用磷酸化基序抗体富集到的磷酸化肽段和利用IMAC或者TiO2富集到的磷酸
化肽段有很强的互补性,即这两种方法都覆盖了整个磷酸组的一部分。Heck等[9]发现,从同样的Jurkat T细胞中,二维SCX-IMAC方法和利用PKA底物磷酸化基序抗体方法可以分别鉴定出10558和228个磷酸化位点,但是其中只有22个位点被两种方法共同鉴定出来。而且在PKA基序抗体鉴定出的206个独特的位点中,研究人员发现很多新的PKA的底物以及与前列腺素E2介导的cAMP信号传导通路中的关键结点[9]。
 
研究人员也通过实验数据验证了上述结论:通过将具有类似基序的抗体合并入一组进行单一免疫富集(例如将PKA、PKC、AMPK、Akt基序抗体组成亲碱性抗体组,因以上基序抗体都识别两侧有碱性氨基酸的磷酸化位点) , 发现与利用IMAC方法富集得到的磷酸化位点相比,基序抗体组免疫沉降鉴定出的磷酸化位点的独特性非常高(图3)。
 
2.2 PTMScan® Direct
    对于某些药物开发的项目,药物的靶点和影响的信号传导通路在前期的生物筛选中已经确定。此时研究者更关心的是药物对该信号传导通路中的蛋白的影响,特别是磷酸化的影响。为此,研究人员开发了6种PTMScan® Direct试剂来针对不同的信号传导包括:Multipathway reagent (分析多条信号传道通路中的关键结点),Ser/ThrKinases和Tyr Kinases reagent(分析对激酶活性有关键调节作用的磷酸化点位),Akt/PI3K Pathwayreagent(分析磷脂酰肌醇3激酶的信号网络),以及Apoptotic/Autophagy reagent (分析细胞凋亡和自体吞噬通路)。如图4所示,PTMScan® Direct中的CellCycle & DNA Damage 试剂可以对细胞周期和DNA损伤通路中的节点蛋白上的关键磷酸化位点进行富集和定量。

    另外,PTMScan® Direct的结果不仅可以给出某一蛋白中某一位点的定量变化,还可以给出这条蛋白的整体表达水平的变化。这样,研究者可以确定某一修饰位点的变化是随着蛋白整体的变化而变化还是一个独立行为。如上述网页地址中的列表所示:DNA损伤标志蛋白之一ATR的表达水平以及ATR上面的428号丝氨酸的磷酸化水平可以同时在最后的结果中反映出来。
PTMScan® Direct的另一优势在于其可分辨同一蛋白家族中的不同亚型。如需要确定某种药物对于抑制受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)的选择性,PTMScan® Direct中的Tyr Kinases试剂提供了一种快速便捷的方法同时定量检测120种酪氨酸激酶上的671个磷酸化位点,如图5所示其结果覆盖了人类酪氨酸激酶家族中的绝大部分成员。
 

3 PTMScan® 技术在不同蛋白翻译后修饰研究中的应用

3.1 PTMScan® 技术在磷酸化修饰研究中的应用
    2007年,研究人员首次发表利用PTMScan®技术对非小细胞肺癌(NSCLC)中酪氨酸激酶组学进行了大规模分析[10],在41个NSCLC 细胞系和超过150个NSCLC 患者样本中比较分析了多种酪氨酸激酶的修饰水平,并发现了除EGFR、c-MET等之外的异常活化的ALK、ROS1、PDGFRA和DDR1参与NSCLC 的发生,并为后续针对活化ALK和ROS1 的药物开发提供了重要依据。
    随后,研究人员又利用AKT底物基序抗体(RxRxxS/T基序抗体)对多种癌症细胞系中由上述突变的受体酪氨酸激酶( 如EGFR、c -MET和PDGFRA等)介导的Akt-RSK-S6信号通路网络的激活进行了系统分析[11]。类似的研究还包括利用ATM/ATR底物基序抗体对UV照射前后的差异磷酸化修饰蛋白谱进行的系统鉴定[12]。

3.2 PTMScan® 技术在泛素化修饰研究中的应用
    为了对人类泛素修饰蛋白质组进行全面分析,Kim等[13]利用K-e-GG基序抗体,在5 000种蛋白中鉴定到19 000个含有K-e-GG位点的肽段,并利用定量蛋白组学方法,对使用蛋白酶体抑制剂或蛋白翻译抑制剂前后的K-e-GG肽段丰度进行了检测,揭示了翻译过程中不同位点泛素化修饰分布和每个泛素修饰位点修饰程度的动态变化,同时还利用这个方法初步鉴定并研究了Culin-RING泛素连接酶的底物。并且,这种K-e-GG基序抗体还可以识别NEDD8和ISG15等类泛素化修饰位
点。随后,Emanuele等[14]研究人员的一项研究就利用K-e-GG基序抗体对Culin-RING泛素连接酶的底物进行了大规模分析。
    Buckley等[15]利用K-e-GG基序抗体并结合鸟枪蛋白质组学方法,对胚胎干细胞分化和诱导多能性过程中泛素化蛋白质进行了系统解读,并结合RNAi着重对蛋白去泛素酶Psmd14和E3连接酶FBXW7在ESC多能性和细胞重编程中的作用进行了研究。而Mathew等[16]研究人员则利用K-e-GG基序抗体对PLZF招募的E3连接酶CUL3在淋巴细胞发挥效应阶段的底物变化进行了系统鉴定。

3.3 PTMScan® 技术在乙酰化修饰研究中的应用
利用乙酰化赖氨酸抗体, 研究人员在包括睾丸、脾、肺、脑、胚胎、心脏、肝脏、棕色脂肪和腓肠肌九个小鼠组织中进行了赖氨酸乙酰化修饰肽段的广泛鉴定,并对蛋白类型分布进行了分析。在这项分析中,研究人员发现6 000多个乙酰化赖氨酸位点,被乙酰化修饰的蛋白类型包括转录因子、翻译相关蛋白、线粒体相关蛋白、蛋白激酶和磷酸酶、RNA加工相关蛋白、蛋白酶、受体和通道蛋白等(图6)[17]。
 
 
    Schwer等[18]另外一项利用乙酰化赖氨酸抗体进行的研究表明,卡路里限制会导致线粒体乙酰化蛋白谱发生明显变化,有72个蛋白的乙酰化水平发生变化。随后,Hirshey等[19]研究小组利用乙酰化赖氨酸抗体,对重要的去乙酰化酶家族成员SIRT3进行了底物鉴定。通过对SIRT3野生型和敲除动物的肝脏中乙酰化蛋白肽段的分析,发现了SIRT3缺失后线粒体蛋白质长脸酰基辅酶A脱氢酶(LCAD)的第42位赖氨酸乙酰化水平明显升高,这是首次对SIRT3的底物进行了鉴定,后续的多项研究都借用了这个方法[20]。

3.4 PTMScan® 技术在甲基化修饰研究中的应用
    CST公司首创的精氨酸和赖氨酸位点甲基化(Methyl-Arginine or Lysine)基序抗体已经高效应用于大规模的甲基组的鉴定。科研人员利用不同的精氨酸和赖氨酸甲基化基序抗体将HCT116细胞中的甲基化蛋白谱进行了分析,发现718个精氨酸单甲基化蛋白、188个精氨酸非对称二甲基化蛋白、204个赖氨酸单甲基化蛋白、75个赖氨酸二甲基化蛋白、36个赖氨酸三甲基化蛋白。根据目前发现的甲基化修饰蛋白类型,我们推测利用上述基序抗体,可以对染色质相关蛋白、转录因子、DNA损伤和RNA加工相关蛋白的甲基化过程进行进一步分析[21]。

    综上所述,利用PTMScan®技术的蛋白翻译后修饰基序特异性抗体进行免疫亲和富集,并联合液相色谱-质谱分析的新技术策略能够在多种翻译后修饰研究中加以广泛应用,可以有效提高翻译后修饰肽段的检测灵敏度,为快速、准确、高通量地筛选和评价多种疾病相关信号通路关键节点蛋白翻译后修饰提供了新思路,可以满足创新性研究、生物标志物鉴定、药物靶点筛选和评价的需求。

致谢感谢Cell signaling Technology公司PTMScan Group提供的所有原始数据和图表,以及对文章的科学性进行审核。
 
 
 
参考文献(略)
 
 
 
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